La viscosità del fluido extracellulare migliora la migrazione cellulare e la diffusione del cancro

Natura volume 611, pagine 365–373 (2022)Citare questo articolo

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Le cellule rispondono a stimoli fisici, come rigidità1, sollecitazione di taglio del fluido2 e pressione idraulica3,4. La viscosità del fluido extracellulare è un segnale fisico chiave che varia in condizioni fisiologiche e patologiche, come il cancro5. Tuttavia, la sua influenza sulla biologia del cancro e il meccanismo con cui le cellule percepiscono e rispondono ai cambiamenti di viscosità sono sconosciuti. Qui dimostriamo che una viscosità elevata aumenta controintuitivamente la motilità di vari tipi di cellule su superfici bidimensionali e in confinamento e aumenta la diffusione cellulare da sferoidi tumorali tridimensionali. L'aumento del carico meccanico imposto dall'elevata viscosità induce una rete di actina densa dipendente dal complesso della proteina correlata all'actina 2/3 (ARP2/3), che migliora la polarizzazione dello scambiatore Na+/H+ 1 (NHE1) attraverso il suo partner legante l'actina ezrin. NHE1 promuove il rigonfiamento cellulare e l'aumento della tensione della membrana, che, a sua volta, attiva il catione vanilloide 4 (TRPV4) del potenziale recettore transitorio e media l'afflusso di calcio, portando ad un aumento della contrattilità cellulare dipendente da RHOA. L'azione coordinata del rimodellamento/dinamica dell'actina, del rigonfiamento mediato da NHE1 e della contrattilità basata su RHOA facilita una maggiore motilità a viscosità elevate. Le cellule del cancro al seno pre-esposte a viscosità elevata acquisiscono una memoria meccanica dipendente da TRPV4 attraverso il controllo trascrizionale della via Hippo, portando a un aumento della migrazione nel pesce zebra, allo stravaso negli embrioni di pulcino e alla colonizzazione polmonare nei topi. Nel complesso, la viscosità extracellulare è un segnale fisico che regola i processi cellulari sia a breve che a lungo termine con rilevanza fisiopatologica per la biologia del cancro.

La migrazione cellulare è essenziale per una varietà di processi fisiopatologici, come lo sviluppo, l’omeostasi dei tessuti, la sorveglianza immunitaria e la metastasi del cancro. Sebbene sia stato dimostrato che le forze meccaniche derivanti dalle interazioni cellula-substrato e dal fluido circostante regolano il comportamento di migrazione cellulare, l'effetto delle viscosità extracellulari fisiologicamente rilevanti sulla funzione cellulare rimane poco chiaro. Ad oggi, la maggior parte dei test funzionali cellulari in vitro, inclusa la motilità, vengono eseguiti in un mezzo con una viscosità vicina a quella dell'acqua (0,7 centipoise (cP) a 37 °C). Tuttavia, la viscosità del fluido interstiziale varia fino a 3,5 cP (rif. 9) e può essere ulteriormente aumentata da macromolecole, come le mucine, secrete non solo dalle cellule epiteliali residenti in vari tessuti ma anche dalle cellule tumorali10. La crescita del tumore primario può comprimere i vasi linfatici e compromettere il drenaggio11, portando all'accumulo di macromolecole nel tempo. L'elevata degradazione della matrice extracellulare nei siti tumorali esacerba anche l'affollamento macromolecolare12, che può aumentare ulteriormente la viscosità del fluido interstiziale13. In particolare, la viscosità fisiologica del sangue intero varia tra 4 e 6 cP e può superare 8 cP in caso di anomalie patologiche14.

Precedenti ricerche hanno dimostrato che le viscosità soprafisiologiche (≥40 cP) aumentano la motilità del carcinoma e delle cellule normali su superfici bidimensionali (2D)15,16. Questo è piuttosto controintuitivo, poiché la viscosità rallenta il movimento delle particelle all’interno dei fluidi. Tuttavia, le principali domande fondamentali e traslazionali rimangono senza risposta, incluso il modo in cui le cellule percepiscono il segnale fisico di una viscosità extracellulare elevata, ma fisiologicamente rilevante; se l'elevata viscosità altera il fenotipo cellulare e i meccanismi sottostanti della locomozione cellulare; come il citoscheletro coopera con canali ionici e trasportatori per mediare una migrazione efficiente a viscosità elevate; se la motilità più rapida osservata in vitro si traduce nell'impostazione in vivo e, in tal caso, se l'esposizione cellulare a una viscosità elevata influisce sulle metastasi del cancro.

Per studiare gli effetti dell'aumento della viscosità del fluido extracellulare sulla funzione cellulare in vitro, abbiamo incorporato le quantità di metilcellulosa da 65 kDa nel terreno di coltura cellulare necessarie per ottenere terreni con viscosità comprese tra 0,77 cP (0%) e 8 cP (0,6%) a 37 °C senza alterare sensibilmente l'osmolarità del mezzo (Dati estesi Fig. 1a,b). Utilizzando le cellule di cancro al seno MDA-MB-231 come modello, abbiamo scoperto che la velocità di migrazione all'interno dei canali di confinamento basati su polidimetilsilossano (PDMS) (larghezza × altezza = 3,5 × 10 µm2)17 (Dati estesi Fig. 1c) aumentava con l'aumentare della viscosità extracellulare , raggiungendo un picco a 5-8 cP (Fig. 1a). I terreni con una viscosità elevata (8 cP) che utilizzano macromolecole alternative biologicamente inerti, come destrano (500 kDa)2 e polivinilpirrolidone K-90, supportano anche una motilità più rapida (Dati estesi Fig. 1d-f), mentre il destrano a bassa massa molecolare (6 kDa), utilizzato con molarità simile (~ 1,95 µM) a 500 kDa destrano, non ha potenziato la migrazione confinata (Dati estesi Fig. 1g). Questi dati rivelano che l'elevata viscosità del fluido extracellulare migliora la migrazione delle cellule MDA-MB-231 in confinamento indipendentemente dalla natura delle macromolecole. Sono state osservate velocità di migrazione migliorate a viscosità elevate anche utilizzando diverse cellule tumorali (cellule metastatiche cerebrali MDA-MB-231-BrM2 derivate dal cancro al seno (di seguito BrM2)18, carcinoma mammario SUM15919 e osteosarcoma umano (HOS)) e cellule non cancerose ( fibroblasti umani normali e cellule muscolari lisce aortiche umane (hAOSMC)) (Fig. 1b).

0.96. The x axis is discontinued between 0.25 and 0.75 to highlight differences at the cell edges. n, Confined migration speeds of SC versus ARP3/ARPC4 double-knockdown cells (n = 90) from 3 experiments. For e, g, j and n, data are mean ± s.d. Unless otherwise indicated, statistical comparison was performed with respect to 0.77 cP. Statistical analysis was performed using Kruskal–Wallis tests followed by Dunn's test (a and n), Mann–Whitney U-tests (BrM2 only) or unpaired t-tests after log-transformation (other cells) (b), unpaired t-tests (e, g and j) and two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Šidák's test (h and m). Scale bars, 250 μm (c), 50 μm (d), 25 µm (f, white), 3 µm (f, red), 10 µm (h), 2 µm (i), 20 µm (l). The cell model was MDA-MB-231 unless otherwise indicated. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001./p>

5 nuclei./p>8 data points, the D’Agostino–Pearson omnibus normality test was used to determine whether data were normally distributed. Datasets with Gaussian distributions were compared using two-tailed Student's t-tests and one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. For log normal distribution, statistical comparison was made after logarithmic transformation of the data followed by unpaired two-tailed Student's t-tests or one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. For non-Gaussian distributions, nonparametricMann–Whitney U-tests were used comparing two conditions, and comparisons for more than two groups were performed using Kruskal–Wallis tests followed by Dunn's multiple-comparison test. Select experiments were analysed using two-way ANOVA followed by Šidák's or Tukey's multiple-comparisons test. Analysis was performed using GraphPad Prism 7, 8 or 9 (GraphPad Software). P < 0.05 was considered to be statistically significant; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. The exact sample size, number of replicates, P values and statistical tests performed are provided in Supplementary Information 5–19./p>

200 cells per ROI imaged, for ≥6 ROIs from 2 experiments. l, Cell entry time in confining channels at the indicated viscosities. Data represent the mean ± s.d. for n = 52 cells from 3 experiments. Tests performed: Kruskal-Wallis followed by Dunn's multiple comparisons (e–g), unpaired t-test (i), and after log transformation of data (h,l), and two-way ANOVA followed by Šidák's multiple comparisons (j,k)./p>

450 events in 20 cells per condition imaged over 3 experiments. h, (Top) Snapshots of confocal micrographs of Lifeact-GFP-expressing MDA-MB-231 cells on 2D at 0.77 cP and 8 cP. The dashed yellow lines are used for kymographs at the bottom. At 0.77 cP, the leading edge extends and contracts rapidly as indicated by the "spikes" in the kymograph (red arrowheads). At 8 cP, the leading edge has slow yet persistent growth (yellow arrowhead) with occasional retraction events (red arrowhead). White bars: 10 µm; for kymographs, black horizontal bar: 5 µm and vertical bar: 30 s. i, Representative time-lapse confocal image sequence of PA-GFP fused actin dynamics after it is activated at the interior of cells on 2D. Red "X" symbols indicate points of UV excitation. Scale bar: 25 µm. j,k, Uninterrupted protrusion growth rate (j) and retrograde actin flow rate (k) in β-actin-mRFP-PAGFP-expressing MDA-MB-231 cells on 2D at 0.77 and 8 cP. Data are mean ± s.d. for n≥ 36 cells from 3 experiments. Tests performed: Two-way ANOVA followed by Šidák's multiple comparisons (b,c), Kruskal-Wallis followed by Dunn's multiple comparisons (d,e), Mann Whitney test (j), and unpaired t-test (k). Images are representative of 3 (a,h,i) experiments./p>

0.05 for all time points between 0.77 and 8 cP for SC versus dual shMIIA/MIIB (m) and vehicle versus Y27632 (n). o,p, (Left) Confocal images showing the spatial localization of MIIA-GFP in cells migrating on 2D at 0.77 and 8 cP (o) or 8 cP only in the presence of vehicle control or Y27632 (p). (Right) Intensity profile along dashed red line in corresponding images. Intensity was normalized to the highest intensity along the scan. Scale bars: 10 µm. q–t, Retrograde actin flow rate (q) and uninterrupted protrusion growth rate (s) in wild-type cells expressing β-actin-mRFP-PAGFP on 2D at 8 cP in the presence of vehicle control, Y27632, GSK 2193874 (GSK2) or CK666. Similar measurements were made for SC and shMIIA cells (r,t). Data are mean ± s.d. for n≥21 cells from ≥2 experiments. Tests performed: Mann Whitney test (a,b,r), unpaired t-test (c) and after log transformation (t), Kruskal-Wallis followed by Dunn's multiple comparisons (e,k,q,s), one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons (f), one-way ANOVA followed by Tukey's between segments in each group (h), and two-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons (m,n). Images in i,o,p are representative of 2 and in g of 5 biological replicas. Cell model: MDA-MB-231./p>

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