Basi strutturali per la regolazione dei lipidi e del rame del trasportatore ABC MsbA

Nature Communications volume 13, numero articolo: 7291 (2022) Citare questo articolo

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Un passaggio fondamentale nella biogenesi del lipopolisaccaride (LPS) prevede il ribaltamento del lipooligosaccaride, un precursore dell'LPS, dal lembo citoplasmatico a quello periplasmatico della membrana interna, un'operazione eseguita dal trasportatore della cassetta legante l'ATP MsbA. Sebbene il legame dell'LPS alla cavità interna di MsbA sia ben consolidato, la selettività delle interazioni MsbA-lipidi in altri siti rimane poco compresa. Qui utilizziamo la spettrometria di massa nativa (MS) per caratterizzare le interazioni MsbA-lipidi e guidare gli studi strutturali. Mostriamo che il trasportatore co-purifica con il rame (II) e il legame metallico modula le interazioni proteina-lipide. Viene presentata una struttura con risoluzione di 2,15 Å di una regione N-terminale di MsbA in complesso con rame(II), rivelando una struttura che ricorda il peptide GHK, un chelante del rame(II) ad alta affinità. I nostri risultati dimostrano affinità di legame lipidico dipendenti dalla conformazione, in particolare per il precursore LPS, acido 3-deossi-D-manno-ott-2-ulosonico (Kdo) 2-lipide A (KDL). Riportiamo una struttura con risoluzione di 3,6 Å di MsbA intrappolata in una conformazione aperta, rivolta verso l'esterno con adenosina 5'-difosfato e vanadato, rivelando un distinto sito di legame KDL, in cui il lipide forma estese interazioni con il trasportatore. Ulteriori studi forniscono la prova che il sito di legame esterno del KDL è conservato e un modulatore allosterico positivo dell'attività dell'ATPasi, che funge da meccanismo di attivazione feedforward per accoppiare l'attività del trasportatore con la biosintesi dell'LPS.

Una caratteristica distintiva della maggior parte dei batteri Gram-negativi è la presenza di lipopolisaccaride (LPS) nel lembo esterno della membrana esterna1,2,3. L'LPS contribuisce alla formazione di una barriera impermeabile che aiuta i batteri a resistere agli antibiotici e agli stress ambientali2. La biogenesi dell'LPS inizia nel citoplasma con la produzione del lipooligosaccaride (LOS) precursore dell'LPS seguito da un trasporto orchestrato sulla superficie cellulare insieme a ulteriori modifiche (Fig. 1a) 4. LOS contiene una porzione conservata di lipide A, un disaccaride bifosforilato della glucosamina (GlcN) con da quattro a sette catene aciliche, decorato con zucchero1 dell'acido 3-deossi-D-manno-ott-2-ulosonico (Kdo). Un'ulteriore decorazione prevede l'attacco di un oligosaccaride centrale, che varia a seconda dei batteri2. Il LOS citoplasmatico viene capovolto dal lembo interno a quello periplasmatico della membrana interna, un passaggio essenziale eseguito dal trasportatore MsbA della cassetta legante ATP (ABC). Poiché l’inibizione o la cancellazione di MsbA è letale5, il trasportatore è emerso come un bersaglio interessante per lo sviluppo di antibiotici. Recentemente sono stati sviluppati piccoli inibitori della MsbA che variano nella modalità di azione, come intrappolare il trasportatore in una conformazione rivolta verso l'interno (IF) o imitare il legame del substrato6,7,8,9,10.

a La biosintesi dei lipopolisaccaridi inizia nel citoplasma per generare lipooligosaccaridi (LOS). LOS è composto da una struttura lipidica A conservata (grigio), un disaccaride bifosforilato della glucosamina, modificato con zucchero dell'acido 3-deossi-D-manno-ott-2-ulosonico (Kdo) (arancione) e oligosaccaride centrale (viola), di cui dipende dai batteri La MsbA, alimentata dall'idrolisi dell'ATP, ribalta il LOS citoplasmatico dal lembo interno a quello esterno della membrana interna, un passaggio essenziale nella biogenesi dell'LPS. Il LOS capovolto viene trasportato sulla membrana esterna insieme ad ulteriori modifiche per diventare LPS. b Lo spettro di massa nativo dei campioni MsbA ottimizzati in C10E5 produce uno spettro di massa ben risolto. c Costanti di dissociazione di equilibrio (KD) per singoli eventi di legame lipidico a MsbA parzialmente caricato. d Deconvoluzione dello spettro di massa mostrato nel pannello b. Le diverse specie molecolari corrispondono a MsbA dimerico e a diversi numeri di ioni rame legati. e La massa misurata di MsbA dopo il caricamento con rame(II) mostra la saturazione di due siti di legame. f KD per eventi di legame lipidico individuale a MsbA completamente caricato con rame (II). Sono riportate la media e la deviazione standard (n = 3, repliche biologiche). I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.