Basi strutturali dell'attivazione della tankyrasi mediante polimerizzazione

Natura volume 612, pagine 162–169 (2022)Citare questo articolo

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La poli-ADP-ribosiltransferasi tankyrasi (TNKS, TNKS2) controlla un'ampia gamma di processi cellulari rilevanti per la malattia, tra cui la segnalazione WNT-β-catenina, il mantenimento della lunghezza dei telomeri, la segnalazione di Hippo, la riparazione del danno al DNA e l'omeostasi del glucosio1,2. Ciò ha incentivato lo sviluppo degli inibitori della tankirasi. Ciononostante, la nostra conoscenza dei meccanismi che controllano l’attività della tankyrasi è rimasta limitata. Sia le funzioni catalitiche che quelle non catalitiche della tankyrasi dipendono dalla sua polimerizzazione filamentosa3,4,5. Qui riportiamo la ricostruzione al microscopio crioelettronico di un filamento formato da un'unità attiva minima di tankyrase, comprendente il dominio del motivo alfa sterile (SAM) polimerizzante e il suo dominio catalitico adiacente. Il dominio SAM forma una nuova doppia elica antiparallela, posizionando i domini catalitici sporgenti per interazioni ricorrenti testa a testa e coda a coda. Le interazioni della testa sono altamente conservate tra i tankyrasi e inducono un interruttore allosterico nel sito attivo all'interno del dominio catalitico per promuovere la catalisi. Sebbene le interazioni della coda abbiano un effetto limitato sulla catalisi, sono essenziali per la funzione tankyrase nella segnalazione WNT-β-catenina. Questo lavoro rivela una nuova modalità di polimerizzazione del dominio SAM, illustra come l'assemblaggio supramolecolare controlla le funzioni catalitiche e non catalitiche, fornisce importanti approfondimenti strutturali sulla regolazione di una poli-ADP-ribosiltransferasi non dipendente dal DNA e guiderà gli sforzi futuri per modulare tankyrase e decifrare il suo contributo ai meccanismi della malattia.

La poli(ADP-ribosil)azione (PARilazione) è una modifica post-traduzionale onnipresente ma poco studiata, implicata in un'ampia gamma di attività biologiche6. Le poli-ADP-ribosiltransferasi PARP1 e PARP2 indotte dal danno al DNA sono bersagli terapeutici nei tumori dell'ovaio, della mammella, della prostata e del pancreas7. Sebbene la loro regolamentazione sia abbastanza ben compresa, quella degli altri due membri della famiglia produttori di PAR, tankyrase 1 e tankyrase 2 (TNKS e TNKS2, rispettivamente; Fig. 1a), non lo è8,9. I processi regolati dalla tankyrasi includono la segnalazione WNT-β-catenina10, il mantenimento e la coesione della lunghezza dei telomeri11, la segnalazione Hippo12, il metabolismo del glucosio13, la mitosi14 e la riparazione del DNA15. Queste funzioni hanno incentivato lo sviluppo di inibitori della tankyrasi con potenziale utilità terapeutica nel cancro, nella neurodegenerazione, nel diabete e nella fibrosi16. Le tankyrasi si assemblano in filamenti elicoidali attraverso il loro dominio SAM polimerizzante3,4,5,17. La polimerizzazione della tankyrasi facilita (1) il legame dei substrati e (2) l'attivazione catalitica di PARP4,5,18 ed è essenziale per la funzione della tankyrasi nella segnalazione WNT-β-catenina, sia attraverso meccanismi catalisi-dipendenti che indipendenti (impalcatura)4, 5,18.

a, organizzazione del dominio di TNKS e TNKS2. b, mappe Cryo-EM (prima dell'affilatura finale in Phenix per la costruzione del modello) di TNKS2 SAM–PARP (a sinistra) e dopo aver mascherato PARP (a destra). I protofilamenti antiparalleli sono legati tra loro dalla simmetria D1. Un sito accettore; D, sito donatore. Le frecce gialle indicano la polarità del protofilamento. c, Rappresentazione schematica della struttura del filamento quaternario, con lettere che indicano diversi protomeri (vedere Dati estesi Fig. 3j). d, mappa crio-EM ulteriormente affinata e modello di un singolo protomero SAM-PARP TNKS2. Il dominio PARP del PDB 5NWG33 è sovrapposto in verde per illustrare le caratteristiche scarsamente risolte del sito accettore. Vedere la Figura 2 dei dati estesi per i dettagli sull'elaborazione dei dati e la Figura 3 dei dati estesi per i dettagli della mappa e l'analisi della mutazione G1032WTNKS2.

Il modo in cui la polimerizzazione della tankyrasi induce la sua attività PARP è rimasto sconosciuto. Qui descriviamo la struttura della microscopia crioelettronica (crio-EM) da 3 Å di un'unità polimerica minima attiva di tankyrasi, rivelando una nuova architettura a doppia elica che consente interazioni reciproche tra domini PARP per attivare allostericamente tankyrasi.

0.05). See Extended Data Fig. 9c,d for data from the +tankyrase inhibitor condition. g, Model for the activation of catalytic and non-catalytic tankyrase functions by polymerization. The dashed arrow indicates de-polymerization. Double-headed red arrows indicate interactions./p>monomeric); Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a), in line with polymerization inhibition by auto-PARylation3. Additionally breaking SAM–SAM head-to-tail contacts (G1032WPARP Y920ASAM)4 resulted in nearly 100% monomers (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Although the PARP–PARP head combination mutant was just as catalytically impaired as G1032WPARP (see above), it appeared less polymeric (approximately 35% >monomeric), also than the wild-type protein, indicating that PARP–PARP head interactions contribute to polymerization. Note, however, that the studied species are probably dissociation products of larger polymers lost by dilution as PARP–PARP contacts are not expected to form in these very short filaments (see Discussion). The H1048AD-loop mutation conferred increased polymerization, comparable with G1032WPARP, suggesting that the associated reduction in catalytic activity is sufficient to favour polymerization (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Mutation of the interprotofilament contact (R896DSAM) and SAM/linker–PARP interface (on the SAM domain side) did not detectably reduce polymerization (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Variants containing combined PARP domain mutations in the PARP–PARP tail and SAM/linker–PARP interfaces appeared less monomeric, but presented with a higher tendency to stick to the glass surface, potentially due to aggregation, hindering reliable quantification (Extended Data Fig. 9a,b and Supplementary Video 1)./p>

monomeric events, with s.e.m., using Microsoft Excel for Mac (v16.57) and GraphPad Prism (v9.3.1). Note that the quantifications in Fig. 5e and Extended Data Fig. 9b show the percentages of particles that are monomeric or multimeric; this is distinct from the percentages of protein molecules in different assembly states (monomeric or >monomeric). For example, a mass photometry peak corresponding to dimers and of equal height to the monomer peak contains twice as many proteins./p>

monomeric species used for quantification. The three species marked with asterisks have poorer separation between peaks due to a higher tendency of molecules to repeatedly bind and unbind to and from the glass surface (see Methods for details). b, Analysis of mass photometry data for additional PARP domain mutant variants as in Fig. 5e (n = 5 independent experiments; individual data points and means; error bars, SEM). Data for controls (WT, G1032WPARP, G1032WPARP Y920ASAM) are identical to Fig. 5e and shown again for reference purposes. As for a, the three species marked with asterisks should be interpreted with caution. c, Fluorescence microscopy as in Fig. 5f, but after application of a tankyrase catalytic inhibitor. d, Quantification of c (n = 3 independent experiments; individual data points and means; error bars, SEM). e, Differential scanning fluorimetry of the indicated variants of His6-MBP-TNKS2 SAM-PARP. Data are means from three parallel technical replicates. f, g, Coomassie-stained SDS-PAGE gels of purified His6-MBP-TNKS2 SAM-PARP fusion proteins for quality control. Sufficiently high protein yield did not require repeated purifications for most of the variants (n = 1)./p>

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